پشتیبانی فنی مولکولی

PCR    از سه مرحله اصلی تشکیل شده است که هر چرخه را تشکیل می دهد. واکنش PCR در زمان واقعی واکنش ها معمولاً در 40 چرخه یا سیکل اجرا می شود. مراحل:

• مرحله ی دناتوره سازی: از انکوباسیون با دمای بالا استفاده می شود تا سبب شود DNA دو رشته ای به تک رشته ها تبدیل و ساختار های ثانویه DNA تک رشته ای سست گردد. معمولا دمای مورد استفاده در این مرحله 95 درجه سانتیگراد می باشد. اگر محتوای الگوی GC بالا باشد امکان افزایش این دما در مرحله ی دناتوراسیون وجود دارد.
• مرحله جفت شدن: در حین این مرحله، مکمل توالی ها فرصتی برای هیبرید شدن با مناطق مورد نظردر توالی هدف را دارند. این دما بسته به نوع پرایمرها متغیر است و بر اساس دمای ذوب پرایمر های مورد استفاده تنظی می گردد.
• مرحله ی گسترش: در دمای حدودی 70-72 درجه سانتی گراد، فعالیت DNA پلیمراز در بهینه ترین حالت خود قرار دارد. در این مرحله آنزیم Taq DNA پلیمر از، پرایمرها را روی DNA تک رشته‌ای امتداد می‌دهد تا DNA دو رشته ای جدید ساخته شود.

در واکنش qRT-PCR تک مرحله ای، واکنش سنتز cDNA و واکنش Real-time PCR در یک ویال واحد و به صورت واحد انجام می شود که این امر سبب ساده کردن راه اندازی واکنش و کاهش احتمال آلودگی آغازگرهای اختصاصی ژن (GSP) مورد نیاز می گردد.

در واکنش qRT-PCR دو مرحله ای ، واکنش سنتز cDNA و واکنش Real-time PCR در  دو ویال جدا انجام می گردد.

 در واقع نمونه ی سنتز شده به عنوان تمپلیت برای مرحله PCR استفاده می شود. از مزایای این روش  استفاده از پزلیمر های متنوع برای یک نمونه ی واحد و امکان انتخاب و تغییر شرایط بافری، انتخاب آنزیم‌های مختلف و تنظیم شرایط واکنش می باشد.

PCR دو مرحله ای امکان تهیه cDNA کل را با رونویسی معکوس با استفاده از پرایمرهای universal را فراهم می کند و از cDNA حاصل می توان برای تشخیص انواع رونوشت ها استفاده کرد. در مقابل، qRT-PCR  یک مرحله ای از پرایمرهای اختصاصی ژن برای رونویسی معکوس و امکان تشخیص بسیار حساس یک ژن خاص را فراهم می کند. بنابراین، محققان می توانند یک پروتکل qRT-PCR را با توجه به هدف آزمایشی انتخاب کنند. qRT-PCR دو مرحله ای  می تواند برای تجزیه و تحلیل بیان تعداد زیادی ژن و qRT-PCR یک مرحله ای برای تجزیه و تحلیل یک ژن مورد استفاده قرار گیرد. مزیت اضافی qRT-PCR یک مرحله ای وجود گردش کار تک لوله ای است که از نیاز به اضافه کردن معرف های اضافی در نیمه راه جلوگیری می کند و در نتیجه کاهش خطر آلودگی را به همراه دارد.

DNA پلیمراز: عملکرد PCR اغلب به DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت مرتبط است، بنابراین انتخاب آنزیم مناسب بسیار مهم است که نه تنها بازده بالایی در تمام طول واکنش ارائه کند بلکه در دماهای بالا نیز فعالیت خوبی داشته باشد.

آنزیم:Reverse transcriptase آنزیم‌هایی هستند که قادر به سنتز DNA از روی RNA می باشند. این آنزیم‌ها عموماً منشأ ویروسی (رتروویروس) دارند.

dNTPs: دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته نقش مهمی در واکنش دارند، در واقع dNTPs بلوک‌های ساختاری هستند که DNA پلیمراز با کمک و همراهی آن‌ها ، رشته‌های جدید را ایجاد می کند.

غلظت منیزیم: در واکنش qRT-PCR، کلرید منیزیم یا منیزیم سولفات معمولاً در غلظت نهایی 3 میلی مولار استفاده می شود. این غلظت برای اکثر اهداف به خوبی کار می کند.