کیت الایزا

خطاهای تکنیک الایزا

الایزا به علت حساسیت زیادی که به محیط و هم چنین خطاهای کاربری دارد تستی است که نیازمند دقت و حساسیت بیشتری است. گاهی این خطاها ناشی از خود ما و یا گاهی ناشی از ریجنت ها و موادی هست که برای این منظور مورد استفاده قرار می دهیم. در زیر به بررسی برخی از این خطاهای کلی و جرئی  و همچنین انتخاب بهترین راه حل جهت رفع این خطا ها می پردازیم. باید در نظر داشته باشیم که همه خطاهای الایزا مربوط به اپراتور نیست و محلول هاو همچنین موادی که در الایزا مورد استفاده قرار می گیرند گاهی باعث خطا می شوند. آلودگی سر پیپت ها و همچنین ریجنت ها با میکروارگانیسم ها یکی از این دلایل است.

در دپارتمان ایمونواسی شرکت رادمان تشخیص پارس سعی بر آن شده است که یکسری از خطا های رایج تکنیک الایزا را برای راحتی کار مصرف کنندگان کیت های الایزای این شرکت بیان کنیم:

یکی از خطاهای رایج انتخاب طول موج اشتباه است

 اگر چاهک دارای رنگ شدید یا متوسطی باشد ولی میزان OD آن کمتر از یک باشد باید طول موج بررسی شود. برای کارهای حساس الایزا بهتر است که از آب سه بار مقطر شده استفاده شود.

بعد از انکوبه کردن، مقدار رنگ خیلی کم و یا اصلا قابل مشاهده نیست مشکل می تواند از سوبسترا باشد:

•  هیدروژن پراکسید اضافه نشده است آن را چک کنید.
•  محلول استوک هیدروژن پراکسید غیر فعال است آن را دوباره تیتر کنید.
• بافر بلاک کننده در مرحله جذب آنتی ژن اضافه شده است آن را بررسی کنید.
•   رقت نامناسب هیدروژن پراکسیداز آن را چک کنید.

ایجاد رنگ در سراسر پلیت

•  کونژوگه خیلی قوی است، رقت را بررسی کنید.
•  کونژوگه با ماده ای غیر از ماده اصلی واکنش داده است، با کنترل مناسب بررسی شود.
• عوامل سرم در سرم حرارت داده شده، نمونه سرم را حرارت ندهید.

ایجاد رنگ تکه تکه

•  پوشش ضعیف و متغیر ریجنت با پلیت، بافر پوششی  coating buffer یکنواخت کووت شده باشد.
•  وجود حباب در حین پیپت کردن، اجتناب کردن از شستشو و پیپتینگ شدید.
• پلیت های  معیوب ، استفاده از پلیت های مناسب و استاندارد
• میکس ناکافی ریجنت و نمونه، اطمینان از میکس شدن کافی نمونه.
•  رقت ها به صورت ناقص انجام گرفته است، راه حل ها: کالیبره کردن سمپلر، دقت در پیپت کردن
• شستشوی ناکافی، اجتناب از عدم استفاده از مواد شوینده در محلول شستشو، مطمئن شدن از عدم به دام افتادن حباب در دیواره پلیت
• غلظت بالای یکی از ریجنت ها، بنابراین باید مجددا رقت را بررسی کنید. 

 گسترش رنگ با سرعت کم

• ضعیف بودن کونژوگه، تیتر مورد بازبینی قرار بگیرد دوباره تیتر کنید.
• آلودگی که باعث متوقف شدن فعالیت آنزیم می شود(مانند سدیم آزید برای پراکسیداز). از نگهدارنده های مناسب استفاده کنید.
• دمای پایین انکوبه، مطمئن شوید که دمای مناسب است.
•  PH مناسب نیست، بررسی شود.

خطاهای غیر منتظره

• فرمت پلیت نامناسب است، بررسی شود.
•  رقت ها به صورت درست تهیه نشده اند.
•  خطای واضح در پروتکل، بررسی شود.
•  مقدار رنگ با چشم متناسب با مقدار خوانش الایزا رید نیست، آلودگی بررسی شود، فیلتر ها چک شود، طول موج مناسب انتخاب شود.

جرئیات خطاهای الایزا

• خطاهای مخدوش کننده دقت الایزا- وجود دقت در انجام آزمايش در شرايط متفاوت (آزمايشگاه ، محلول ، كاربر و دستگاه متفاوت)
• خطاهای مخدوش کننده صحت الایزا
• خطاهای مخدوش کننده حساسیت الایزا
• اشکالات ماهیتی کیت

۱- عدم رعایت روش ذکرشده در بروشور (کمپانی سازنده ممکن است بدون اطلاع قبلی روش کار خود را عوض کند).

۲- باز کردن فویل حاوی پلیت (بلافاصله بعد از آنکه از یخچال خارج شد): پلیت سرد، بخار آب موجود در هوا را به قطرات کوچکی تبدیل می‌کند که روی جدارهای چاهک‌ها خواهد نشست. این عمل سبب می‌شود که در برخی تست‌ها که حجم نمونه کم است (مثلاً ۱۰ میکرولیتر) نمونه رقیق شود. در هنگام باز کردن فویل حاوی پلیت به کپسول نم‌گیر موجود در آن دقت شود. اگر پوشش فوق سوراخ باشد کپسول نم‌گیر تغییر رنگ می‌دهد و یا سیلیکاژل موجود در آن به هم می‌چسبد.

۳- اثر همولیز بر روی نتایج: هموگلوبین به دلیل ماهیت پروتئینی، فعالیت پراکسیدازی داشته و همچنین به دلیل وجود آهن و هم می‌تواند سرعت واکنش پراکسید هیدروژن و کروموژن را تسریع کرده و به‌طور کاذب باعث افزایش جذب نوری شود. از طرفی هموگلوبین واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را دستخوش تغییر می‌کند و زمان به تعادل رسیدن واکنش را افزایش می‌دهد (مثل Free T4 که به‌طور کاذب کاهش می‌یابد).

۴- تأثیر ضد انعقاد استفاده‌شده: ضد انعقاد EDTA به‌عنوان شلاته‌کننده یون‌های فلزی می‌تواند روی ZN  که به‌عنوان کوفاکتور آنزیم آلکالین فسفاتاز است را مهار ‌کند. فلوئور سدیم که به‌عنوان نگهدارنده قند استفاده می‌شود می‌تواند فعالیت آنزیم اوره‌آز را مهار ‌کند، بنابراین در سنجش‌هایی که از آنزیم اوره‌آز به‌عنوان ماده نشانگر استفاده شده است، تداخل می‌کند . سدیم آزاید به‌عنوان یک مهارکننده قوی آنزیم پراکسیداز است و هرگز نباید در سنجش‌هایی که نشانگر آنزیمی آنها پراکسیداز است از نمونه حاوی سدیم آزاید استفاده شود .

۵- پلیت‌ها در هنگام رنگ‌زایی باید در دمای ۲۵-۱۸ درجه سانتیگراد قرار گرفته و در معرض باد سرد و گرم نباشند چرا که دمای محیط می‌تواند سرعت واکنش رنگ‌زایی را تغییر داده و در نتیجه منجر به رنگ‌زایی کم یا زیاد شده و با بی‌اعتبار کردن کنترل مثبت و منفی کل کار انجام شده را بی‌اعتبار  invalid کند .

۶- خطا در زمان انکوباسیون (خطای زمانی در انکوباسیون‌های کوتاه‌مدت بیشتر است). در مرحله انکوباسیون و در اثر آنزیم به یک محصول رنگی – تبدیل می‌شود- به‌هیچ‌وجه از فویل آلومینیومی برای پوشاندن سطح پلیت استفاده نشود.

مشکلات مرتبط به شستشو در تکنیک الایزا:

عمل شستشو جهت جدا کردن ترکیبات اتصال‌یافته به کف چاهک از ترکیباتی که متصل نشده‌اند صورت می‌گیرد. غیر از ترکیبات محلول شستشو، نکات دیگری نیز باید مدنظر قرار گیرد.

فشار بالای شستشو در روش دستی ناشی از تخلیه سریع بافر است که منجر به جدا‌سازی و حذف اتصالات اختصاصی از کف چاهک‌ها و کاهش کاذب   OD می‌گردد.

فشار پایین شستشو به علت تخلیه آهسته بافر در روش‌های دستی منجر به عدم دفع کامل اتصالات غیراختصاصی و افزایش کاذب جذب نوری OD می‌گردد .

مشکلات مربوط به شستشو به‌سختی قابل تشخیص بوده و به‌صورت اتفاقی با خوانده‌هایی که خیلی بالا و یا پایین باشد مشخص می‌شوند. رفع این مشکل کالیبره کردن مجدد دستگاه شوینده است. محلول شستشو معمولاً غلیظ‌تر بوده و باید در آزمایشگاه رقیق شود. اگر رقت درست صورت نگیرد و محلول غلیظ‌تر از حد توصیه‌شده باشد، منجر به تخریب و جدا شدن مولکول‌های اتصال‌یافته می‌شود و برعکس کاهش توانایی محلول شستشو بدلیل رقیق‌سازی زیاد باعث عدم جدا شدن اتصالات غیراختصاصی و ایجاد جذب زمینه‌ای بالا می‌شود. مرحله شستشو حداقل باید سه بار انجام شود و محلول اضافی باید تخلیه شده و یا آسپیره گردد. در نهایت باید محلول اضافه داخل چاهک با کوبیدن بر سطح یک کاغذ یا دستمال نم‌گیر خالی شود .

۷- Soak time:  رعایت زمان خیس خوردن سبب می‌شود که اتصالات غیراختصاصی از چاهک‌ها کنده شود. عدم رعایت این موضوع موجب ایجاد یک رنگ زمینه در کل چاهک‌های پلیت کاری خواهد شد و اگر تست فاقد چاهک بلانک باشد این موضوع منجر به ایجاد جواب‌های کاذب می‌شود. این زمان در بروشور کیت آمده است و بین ۳۰ ثانیه تا چند دقیقه متغیر است.

۸- لیپمی در سنجش آنالیت‌هایی که یک مولکول آب‌گریز است بدلیل آنکه توزیع آنالیت بین دو فاز آب‌گریز و آب‌دوست به دلیل وجود لیپید مختل می‌شود و همین‌طور در بعضی از آنالیت‌ها که به پروتئین حامل متصل می‌شود وجود اسید چرب آزاد ممکن است در اتصال آنالیت به پروتئین حامل تداخل نماید و سبب افزایش کاذب میزان آنالیت آزاد می‌شود (به‌خصوص هورمون‌های تیروئیدی و استروئیدی)، بنابراین ناشتا بودن در این آزمایش‌ها ضروری است.

۹- تماس دﺳﺖ ﺑﺎ ﻧﻮک ﺳﻤﭙﻠﺮ و آلودگی ﺑﺎﮐﺘﺮﯾﺎل آن می‌تواند ﻣﻨﺠﺮ ﺑﻪ آلودگی ﻣﺤﻠﻮل کنژوگه و ﺗﻀﻌﯿﻒ ﯾﺎ ﺧﻨﺜﯽ ﺷﺪن ﻣﻌﺮف کنژوگه ﮔﺮدد. اﺳﺘﺎفیلوکوک‌ها و اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﮐﻮک‌ها به‌واسطه رﺳﭙﺘﻮر FC  در ﺑﻪ ﺟﺬب غیراختصاصی اﯾﻤﻮﻧﻮﮔﻠﻮﺑﯿﻦ G در ﻣﺤﯿﻂ ﺑﻮده و ﻣﻨﺠﺮ ﺑﻪ ﺟﺬب آﻧﺘﯽ‌ﺑﺎدی کنژوگه و ﺗﻀﻌﯿﻒ ﺗﯿﺘﺮ کنژوگه می‌گردند.

۱۰- اثر حاشیه‌ایEdge effect انکوباتور ۳۷ درجه ‌سانتی‌گراد به‌واسطه شوک حرارتی و اختلاف حرارت محیط کار و محیط داخلی انکوباتور حاصل می‌گردد و عمدتاً در سطح استریپ‌هایی که مجاور درب خارجی انکوباتور قرار دارند ایجاد می‌شود و جذب نوری OD غیریکنواخت خصوصاً در استریپ‌های ابتدایی حاصل می‌شود. این امر به‌واسطه ورود ناگهانی سرمای محیط به داخل انکوباتور است، لذا از انکوباسیون پلیت‌های الایزا در مکان‌هایی که شرایط محیطی متغیر دارند، پرهیز گردد.