ژن BRAF کد کننده ی پروتئین سرین/ تیروزین کینازی می باشد که نقش کلیدی در تنظیم مسیر های سلولی MEP/ERK کینازی، از مسیرهای موثر در روی رشد و تکثیر سلول ها، دارد. جهش های سوماتیکی در ژن BRAF، در بسیاری از سرطان ها از جمله non-Hodgkin lymphoma، سرطان روده بزرگ، ملانومای بدخیم، تیروئید کارسینوما و سرطان ریه مشاهده می شود. از شایع ترین جهش های ژن BRAF، جهش از نوع جایگزینی در کدون 600 می باشد که سبب فعال شدن بخش دومین کینازی و فعال شدن دائمی پروتئین می شود. موتاسیون ژن BRAF به طور عمومی در تومور هایی که فاقد جهش در ژنهای EGFR، KRAS و NRAS هستند اتفاق می افتد.

دامنه کاربرد

کیت RTP BRAF کیت تشخیصی، جهت شناسایی کیفی جهش های سوماتیکی در کدون 600 ژن BRAF در DNA ژنومی استخراج شده از انواع بافت توموری (بافت تازه، یخ زده و پارافینه) می باشد.

لیست موتاسیون های قابل شناسایی توسط کیت RTP BRAF در جدول 1 ، آورده شده است:

تغییرات نوکلئوتید	جهش	شماره ویال
c.1799T>A	V600E	1
c.1799_1800TG>AA	V600E Complex	2
1799_1800TG>AT	V600D	3
c.1799T>G	V600G	4
c.1798_1799GT>AA	V600K	5
BRAF c.1798G>A	V600M	6
c.1798_1799GT>AG	V600R	7

مبنای واکنش

کیت بر پایه تکثیر اختصاصی توالی جهش یافته معین در نمونه های شامل ترکیبی از آلل وحشی و موتانت مورد نظر،  از طریق ARMS PCR^[1] طراحی شده است که امکان تکثیر انتخابی آلل های جهش یافته و نرمال را فراهم می کند. تکثیر انتخابی به دلیل عدم تطابق ایجاد شده برای پرایمرها اتفاق می افتد. ایجاد عدم تطابق در انتهای ۳‘پرایمر، دمای اتصال به نقطه هدف (Annealing) را برای آلل مورد تظر تغییر می‌دهد. از آنجایی که Taq DNA پلیمراز قادر به انجام فعالیت اگزونوکلئاز نیست، در صورت عدم تطابق سنتز رخ نمی دهد. دقت طراحی پرایمرها سبب می گردد تا مقادیر بسیار اندک موتانت در نمونه هایی که اکثریت توالی غیر جهش یافته هستند قابل شناسایی باشد.

*پروب DNA مورد استفاده برای تشخیص تکثیر موتانت BRAF فلوفور FAM می باشد.

*برای تشخیص محصول واکنش PCR کنترل داخلی  (IC)  ازرنگ فلورسنت Hex استفاده شده است.

ویژگی های کاربردی

• تکثیر انتخابی موتانت BRAF از طریق ARMS PCR
• قابلیت تشخیص 7 جهش مختلف در یک تست.
• واکنش بصورت مولتیپلکس طراحی شده است و وجود یک کنترل داخلی در واکنش از ایجاد نتایج منفی کاذب جلوگیری می‌کند.
• کیت تشخیصیRTP BRAF دارای سرعت بالا، کارآیی آسان برای کاربر می باشد و با انواع دستگاه های Real -Time  PCR  موجود در بازار سازگار می باشد.

شرایط نگهداری کیت

دمای نگهداری	دمای  -15 تا -20 درجه ی سانتی گراد
حساسیت به نور و دما	محلول پرایمر و پروب ها به نور حساس هستند.
تعداد دفعات ذوب	اجزای کیت  قابلیت سه مرتبه متوالی ذوب و انجماد را دارند. از ذوب و انجماد محلول ها بیش از سه مرتبه جدا خودداری کنید.
تاریخ انقضا	از زمان تولید به مدت 12 ماه

کمترین حد شناسایی (LOD)

کمترین حد شناسایی به معنای کوچکترین مقدار نشانگر هدف می باشد که می تواند دقیقاً شناسایی شود. LOD کیت BRAF به عنوان کمترین مقدار DNA جهش یافته در پس‌زمینه DNA نوع وحشی تعریف می‌شود که در آن یک نمونه جهش یافته نتایج مثبت جهش را در 95٪ آزمایش‌ها ارائه می‌دهد. کمترین حد شناسایی موتاسیون برای این کیت برابر با 1% معادل 5 میکروگرم می باشد.

مشخصات

ویژگی های کیت RTP BRAF به صورت اختصاری در جدول زیر ارائه شده است:

توضیحات
روش مورد استفاده	ARMS PCR
نوع نمونه	خون
تعداد جهش مورد شناسایی	V600 BRAF7 نوع موتاسیون در کدون
مدت زمان انجام واکنش	90 دقیقه
تعداد تست	24 تست

---

[1] Amplification Refractory Mutation System PCR