نقطه آغاز هر اقدامی در زیست‌شناسی مولکولی، استخراج اسیدنوکلییک است. از زمان اولین استخراج DNA که توسط فدریش میشر در سال 1869 انجام شد، دانشمندان در تلاش برای طراحی روشهای استخراج مولکولی هستند که قابل‌اطمینان‌تر، سریع‌تر، مقرون‌به‌صرفه‌تر با بازدهی بیشتر باشد. DNA می‌تواند از نمونه‌های گوناگون کلینیکی مثل ترشحات بدن و بیوپسی استخراج شود. حتی می‌توان از نمونه‌هایی مثل یک قطره خشک شده خون، سوآپ دهان یا اثر انگشت شخص، خاک، بافت گیاهان و حیوانات، حشرات، پروتوزواها، باکتری‌ها و مخمرها، ماده ژنتیکی را استخراج کرد.
روشی برای استخراج مولکولی
وقتی روشی را برای استخراج DNA انتخاب می‌کنیم، مهم است که بدانیم کیفیت و کمیت DNA استخراج‌شده چقدر است تا دریابیم روشی که استفاده می‌کنیم مناسب هست یا خیر. عامل دیگری که برای استخراج DNA باید درنظرگرفته شود زمان، هزینه، مقدار سمیت، مقدار رسوب، امکانات آزمایشگاه و مهارت شخص انجام‌دهنده و نمونه مناسب برای کیت استخراج است.
درگذر زمان روشهای استخراج DNA متفاوتی ابداع شده‌اند. از جمله روش های شایع می توان به روش های استخراج آلکالین یا قلیایی، Silica Matrices ، SDS-Proteinase K ، Silica column-based و Magnetic beads اشاره نمود که در ادامه به تک‌تک آنها نگاه کوتاهی می‌اندازیم.
استخراج مولکولی مبتنی بر روش Alkaline
از این روش عمدتا برای استخراج DNA پلازمیدی از سلول باکتری استفاده میشود. در این روش نمونه ابتدا در محلول قلیایی حاوی NaOH و مواد شوینده SDS جهت از بین رفتن غشا سلولی و باز شدن ساختار پروتئین‌ها گذاشته میشود. همچنین آلکالین به‌طور انتخابی شرایطی ایجاد می کند تا با دناتوره کردن DNA باکتریایی بدلیل وزن مولکولی بالاتر، DNA پلازمیدی دورشته ای با خلوص و کیفیت بهتری استخراج گردد. اضافه شدن استات پتاسیم و خنثی شدن محلول سبب شکل گیری مجدد DNA باکتریایی و رسوب آن در ته لوله می گردد. DNA پلازمید دو رشته ای پس از سانتریفیوژ در مایع رویی باقی می ماند. از محدودیت‌ها این روش، می توان به حساسیت DNA پلازمیدی به آلوده‌شدن با DNA باکتریایی قطعه‌قطعه‌شده اشاره نمود.
استخراج مبتنی بر روش Silica Matrices
این تکنیک استخراج مولکولی مبتنی بر اصل تمایل بالای اتصال ذرات DNA با بار منفی به سطح سیلیکای پوشانیده شده با یون های با بار مثبت می باشد. با اتصال محکم مولکول DNA به ذرات سیلیکا، بقایای سلول لیز شده شسته و از بین می‌روند و درنهایت تنها DNA بر سطح ماتریکس باقی می‌ماند. این روش ساده، سریع، نسبتا کم‌هزینه است و کیفیت DNA به‌دست‌آمده بسیار مطلوب است.
استخراج مبتنی بر روش SDS-Proteinase K
پروتئیناز K یک سرین پروتئاز است که اولین‌بار توسط Ebeling و همکارانش کشف شد. در ین روش برای استخراج DNA حدود ۲۰ تا ۵۰ ماکرولیتر از پروتئیناز K استفاده میشود. سدیم دودسیل سولفات (SDS)نیز برای حل‌کردن غشای سلولی و پوشش هسته و جهت دناتوره‌کردن پروتئین‌ها اضافه میگردد تا DNA در معرض فعالیت پروتیناز K قرار بگیرند. محلول پروتئیناز K و SDS یه مدت 1 تا 18 ساعت در دمای بین 50 تا 60 درجه سانتی گراد انکوبه شده و در نهایت در یکی از روش های فنل-کلروفرم و یا رسوب دهی با نمک جهت استخراج DNA استفاده می گردد.
استخراج مبتنی بر روش Silica column-based
این روش ستونی بوده و در آن از بافری که حاوی EDTA و Tris است و از SDS و پروتییناز K برای لیز کردن نمونه استفاده میشود. پس از انکوباسیون به مدت یک ساعت در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد، مخلوط را به ستونی حاوی سیلیکاژل اضافه می‌کنند.
در روشهای سنتی بدون استفاده از ژل سیلیکا، عموما جلوگیری از آلوده شده DNA با حلال های آلی از طریق ایجاد شدن یک لایه فاز مایع در کنار لایه DNA استخراج شده اتفاق می افتاد که بدلیل امکان تداخل بین دو فاز امکان آلودگی بالا می رود اما در این روش چون تداخلی بین فاز ها ایجاد نمی شود DNA با خلوص بالاتری جداسازیمی گردد. همچنین ژل سلیکا به جلوگیری از تماس فیزیکی با معرف‌های سمی کمک می‌کند و در نتیجه بازده DNA، ۴۰ درصد بیشتر از روش معمول استخراج DNA مبتنی بر حلال آلی گزارش شده است.
استخراج مبتنی بر روش Magnetic beads
در این روش استخراج مولکولی، ذرات مغناطیسی توسط آنتی بادی هایی که روی آنها را پوشانیده اند مولکول DNA را به خود جذب می کنند. این ذرات به‌طورکلی از یک هسته مغناطیسی پوشیده شده با سیلیکا و گروه های سولفات و هیدروکسیل تشکیل شده‌اند. جداسازی ذرات مغناطیسی متصل به DNA از سلول لیز شده به واسطه ی ایجاد یک میدان یک میدان مغناطیسی در پایین لوله با استفاده از یک آهنربای خارجی انجام میگیرد. به این طریق ذرات مغناطیسی همراه با DNA های جداسازی شده در پایین لوله جمع شده و می توان مایع رویی را دور ریخت.
ذرات مغناطیسی سپس با روش رسوب اتانول شستشو داده می شوند. پس از آن ذرات در دمای 65 درجه سانتی‌گراد انکوبه شده تا DNA از آنها جدا گردد. میزان DNA به‌دست‌آمده از این روش با آنچه در روش های مرسوم دیگر حاصل میشود تقریبا یکسان است، همچنین با توجه به اینکه کل پروسه در کمتر از 15 دقیقه انجام میشود در مقایسه با روش های قبلی که طولانی تر هستند بسیار سریع تر است.
علاوه‌بر این، استفاده از این مدل کیتهای استخراج جهت اتوماسیون ایده آل است زیرا به تجهیزات کمی برای اجرا نیاز دارد؛ به عنوان مثال برای انجام به سانتریفیوژ نیازی نیست. مزیت دیگر نسبت به روش های مبتنی برسانتریفیوژ این است بدلیل عدم اعمال فشار خارجی ، آسیب کمتری به ساختار اسید نوکلئیک استخراج شده وارد می گردد. از معایب این روش هزینه بر بودن آن در مقایسه با سایر روش هاست.
جمع‌بندی
با پیشرفت علم، تقاضا برای ایجاد روشهای قابل‌اعتماد و کارآمد جهت استخراج DNA افزایش‌یافته است. هر روز برتعداد و تنوع این روش ها اضافه می شود. هدف طراحی روش هاییست که در عین سرعت، آسانی و کم هزینه بودن، DNA ای با درجه خلوص بالا استخراج نماید. ما در این مقاله سعی کردیم شما را تا حدودی با اصول شایعترین روش هایاستخراج آشنا کنیم. در آینده روش های دیگر را نیز به شما معرفی خواهیم کرد.
